Транскрипция

Транскрипция

Общие сведения

Транскрипция — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с образованием 3'–5'-фосфодиэфирных связей и освобождением неорганического пирофосфата.
Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3'->5'
РНК-полимеразы могут состоять из одной или нескальких субъединиц. У митохондрий и некоторых бактериофагов, например SP6, T7 с небольшим числом генов простых геномов, где отсутствует сложная регуляция РНК-полимераза состоит из одной субъединицы. Для бактерий и эукариот, с большим числом генов и сложными системами регуляции РНК-полимеразы состоят из нескольких субъединиц. Показано, что фаговые РНК-полимеразы состоящие из одной субъединицы могут взаиодействовать с белками бактерий, которые меняют их свойства [Патрушев, 2000].
У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей актвированных нуклеотидов.

Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.
Факторы транскрипции - белки взаимодействующие с друг другом, регуляторными участками ДНК и РНК-полимеразой с образованием транскрипционного комплекса и регулирующие транскрипцию. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК.
Принципы транскрипции
комплиментарность - mRNA комплиментарна матричной цепи ДНК и аналогична кодирующей цепи ДНК
антипараллельность
униполярность
беззатравочность - РНК-полимераза не требует праймера
асимметричность
Стадии транскрипции
  1. распознавание промотора и связывание - РНК-полимераза связывается с ТАТА-боксом 3’-промотора при помощи основных факторов транскрипции, дополнительные факторы ингибируют или стимулируют присоединение
  2. инициация - образование первой фосфодиэфирной связи между Pu и первым нуклеотидом. К пуринтрифосфату присоед нуклеотид комплиментарный второму нуклеотиду ДНК с отщеплением пирофосфата от нуклеозидтрифосфата с образ диэфирной связи
  3. элонгация ( 3’→5’)- мРНК гомологичная нематричной (кодирующей, смысловой) ДНК, синтезируется на матричной ДНК; какая из двух цепей ДНК будет матрицей, определяется направлением промотора
  4. терминация

Транскрипционные фабрики

Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что транскрипция осуществляется в так называемых транскрипционных фабриках: огромных, по некоторым оценкам, до 10 МДа комплексах, которые содержат около 8 РНК-полимераз II и компоненты последующего процессинга и сплайсинга, а также пруф-ридинга новосинтезированного транскрипта. В ядре клетки происходит постоянный обмен между пулами растворимой и задействованной РНК-полимеразы. Активная РНК-полимераза задействована в таком комплексе, который в свою очередь является структурной организовывающей компактизацию хроматина единицей. Последние данные. свидетельствуют о том, что транскрипционные фабрики существуют и в отсутствие транскрипции, они фиксированы в клетке (пока не ясно, взаимодействуют ли они с матриксом клетки или нет) и представляют собой независимый ядерный субкомпартмент. Попытки выделить белковый функциональный комплекс транскрипционной фабрики пока не привели к успеху ввиду его огромных размеров и низкой растворимости.

Транскрипция у эукариот

РНК-полимеразы эукариот

У эукариот имеется 3 типа РНК-полимераз (не считая митохондриальной и хлоропластной):
РНК полимеразаI - синтезирует в ядрышках рибосомные RNA (18S и 28S рРНК, кроме 5S);
РНК-полимеразаII - синтезирует mRNA и некоторых sRNA;
РНК-полимеразаIII - синтезирует tRNA, sRNA, 5S rRNA.
RNA-полимеразы эукариот отличаются: количеством субъединиц – 2 большие (120-220кДа) и до 8 малых (10-100кДа), потребностью в ионах Mg и Mn, чувствительностью к – амонитину - токсину бледной поганки - пептиду включающему D-аминокислоты: polI - устойчива, polII - ингибируется при концентрации 10-8М, polIII - при 10-6М амонитина. РНК-полимеразы I,II,III кодируются в ядре. Большие субъединицы гомологичны β и β`-субъединицам эубактерий.

РНК-полимераза I

РНК-полимераза II

PolII Человека содержит более 10 субъединиц, слабо ассоциирующих друг с другом. Некоторые из них принадлежат к основным факторам транскрипции (GTF).
Белки holo-фермента PolII дрожжей [Патрушев, 2000].
Pol II - РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транскрипции, участвует в выборе точки инициации транскрипции.
TFIIB - Связывает Pol II и TBP на промоторе, участвует в выборе точки инициации транскрипции
TFIIF - Взаимодействует с Pol II, стимулирует элонгацию транскрипции Pol II, компонент субкомплекса SRB/медиатор
TFIIH - Активность ДНК-зависимой ATPазы, ДНК-геликазная активность, обладает активностью CTD-киназы
SRB2, SRB5 - Участвуют в образовании инициационного комплекса, стимулируют базальный и индуцированный синтез РНК,
взаимодействуют с TBP, компоненты субкомплекса SRB/медиатор
GAL11/SPT13 - Участвуют в образовании инициационного комплекса, стимулируют базальный и индуцированный синтез РНК,
компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействуют с активаторами транскрипции
SUG1 - Компонент субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействует с активаторами транскрипции
SRB4, SRB6, SRB7, SRB8, SRB9, SRB10, SRB11 - Компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно
взаимодействуют с CTD-доменом Pol II

РНК-полимераза III

Факторы транскрипции

Инициация

Инициация транскрипции происходит на кэп-сайте кодирующем первый нуклеодид первого экзона мРНК.
ТАТА-бокс локализуется в 25-30 пн выше кэп-сайта связывая РНК-полимеразу перед кэп-сайтом. Промотор - примерно 200 пн выше кэп-сайта. Энхансеры обычно имеют длину 100-200 пн.

Элонгация

Терминация

Терминация на сайте полиаденилирования.

Вновь синтезированная РНК генов связывается с ядерными белками - информомерами, подвергается различным посттранскрипционным модификациям и транспортируется из ядра (см. обзор Процессинг) для последующей трансляции (см. обзор Трансляция).

Транскрипция у прокариот

РНК-полимераза E.coli

РНК-полимераза E.coli осуществляет транскрипцию всех бактериальных генов и состоит из нескольких субъединиц: α-35кДа, β‘-165кДа, β-155кДа, σ-чаще 70кДа (σ70). РНК-полимераза состава ααββ’σ70 называется holo-фермент (Еσ70), состава ααββ’- core-фермент (E).
σ - сменный фактор специфичности, который диссоциирует после инициации транскрипции. Элонгация и терминация осуществляется core-ферментом. У Е.coli ~10 видов σ-субъединиц. Транскрипция генов теплового шока, оперонов gln или nif осуществляется σ54 в составе holo-фермента Eσ54 (54 кДа).
Все субъединицы заряжены отрицательно: σ>α>β>β’ – расположены по убыванию заряда. В каждой субъединице имеется кластер (+)-заряженных участков, которыми они связываются с ДНК. Наибольшее число кластеров у – β’, который участвует в связывании фермента с ДНК, β-субъединица содержит активные центры - инициации и элонгации, α-субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами. Рифампицин – блокирует инициацию, стрептолидигин – блокирует элонгацию, что говорит о разнесении активных центров в РНК-полимеразе.
Узнавание и связывание RNA-pol с промотором осуществляется holo-ферментом
Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы. Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе сигма - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.
Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.
Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.
β' - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.
В β - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

Инициация транскрипции

РНК-полимераза Ecoli узнает два 6н разделенных 25н

Элонгация транскрипции

Терминация транскрипции

Регуляция транскрипции

Схема негативной индукции Жакоба и Моно

негативная регуляция транскрипции Lac-оперона

Lac-оперон E. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков, участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.
Z-β - галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).
Y-β- галактозидпермеаза (переносит лактозу через мембрану клетки).
А - тиогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).
В отсутствие в клетке лактозы lac-оперон выключен. Активный белок - репрессор, кодируемый в моноцистронном опероне (LacI) , не имеющем оператора, связан с оператором lac-оперона. Поскольку оператор перекрывается с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на промотор невозможна.
Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку, две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором, изменяют его конформацию - и он теряеет сродство к оператору.
Тут же начинается транскрипция lac-оперона и трансляция образующейся mРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы.
Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает lac-оперон.

Схема позитивной индукции


В Аra-опероне E. сoli 3 цистрона, которые кодируют ферменты, расщепляющие сахар арабинозу. В норме оперон закрыт. Белок - репрессор связан с оператором.

Когда в клетку попадает арабиноза, она взаимодействует с белком - репрессором. Белок - репрессор меняет конформацию и превращается из репрессора в активатор, взаимодейсивующий с промотором и облегчающий посадку РНК-полимеразы на промотор.
Эта схема регуляции называется позитивной индукцией, поскольку контролирующий элемент - белок - активатор "включает" работу оперона.

Схема позитивной репрессии

В опероне синтеза рибофлавина у Вacilus subtilis располагаются цистроны ферментов синтеза рибофлавина. Есть белок-активатор, обеспечивающий посадку РНК-полимеразы на промотор. В норме оперон открыт. Образуется N молекул рибофлавина.

N+1-ая молекула (лишняя) взаимодействует с активатором и он теряет способность активировать посадку РНК-полимеразы на промотор.

Позитивная репрессия, поскольку в регуляции участвует белок - активатор, а сама регуляция заключается в выключении транскрипции.

Схема негативной репрессии

В опероне синтеза триптофана у E. сoli имеется 5 цистронов, которые кодируют ферменты последовательной цепи реакций синтеза триптофана. В норме оперон включен. Белок - репрессор неактивен (в форме апо-репрессора), он не способен садиться на оператор.

Клетке нужно N молекул триптофана. N+1-ая молекула взаимодействует с апо-репрессором. Он меняет конформацию, садится на оператор и синтез РНК прекращается.

Схема регуляции - негативная репрессия, потому что белок репрессор "выключает" оперон.

Позитивный контроль работы lac-оперона

Lac-оперон, подчиняющийся схеме негативной индукции, имеет и позитивный контроль. цАМФ образуется из АТФ ферментом аденилатциклазой. Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ. Глюкоза активирует второй и инактивирует первый фермент. Чем больше в клетке глюкозы, тем меньше цАМФ.

Если нет глюкозы, то цАМФ соединяется с белком катаболической репрессии (САР) и образуется комплекс САР•цАМФ, активирующий посадку РНК-полимеразы на промотор. В присутствии лактозы lac-оперон включается и работает. Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный источнок энергии), то нет цАМФ - и активатор не образуется, lac-оперон работает слабо, без дополнительной индукции.