Прямая репарация

Существуют два основных пути репарации алкилированных оснований: эксцезионная репарация оснований (BER) и прямая репарация поврежденных оснований. При BER DNA-гликозилазы выщепляют цитотоксичные алкилированные основания в DNA на первом шаге с образованием AP-сайта и последующим его процессированием.В случае прямой репарации реализуются два способа: репарация алкилтрасферазами либо окисление алкильной группы, в обоих случаях происходит регенерация неповрежденных оснований. Если протекает репарация алкилтрасферазами (у млекопитающих только O6-алкилгуанин репарируется по этому пути), то O6-алкилгуанинтрансфераза (AGT) переносит метильную или этильную группу с O6-алкилгуанина на один из собственных остатков цистеина. Алкилированный в результате собственной активности белок инактивируется, но может служить регулятором активности своего гена и нескольких других. В отличие от суицидных O6-метилгуанинтрансфераз, направленно деметилирующих высокомутагенное и токсичное
повреждение O6-метилгуанин, AlkB из E. coli и его человеческие аналоги hABH2 и hABH3 окисляет метильные группы 1-метиладенина (1-meA) и 3-метилцитозина (3-meC) в DNA для регенерации немодифицированных оснований аденина и цитозина.

O6-алкилгуанинтрансфераза

O6-алкилгуанинтрансферазная активность обнаружена у большинства организмов и препятствует мутагенному действию O6-алкилгуанина. AGT превращает O6-алкилгуанин в гуанин, перемещая алкильную группу с DNA на реакционный остаток цистеина в белке в ходе необратимой реакции.

Работа AGT по перемещению алкильной руппы с DNA на реакционный остаток цистеина в белке

Такое ковалентное присоединение алкильной группы к остатку цистеина инактивирует фермент. Поэтому AGT - суицидный фермент, который подвергается протеолитической деградации после одной
реакции трансалкилирования. Структурные исследования позволяют обнаружить, что активный центр AGT расположен в объеме фермента на некотором расстоянии от DNA-связывающего участка. Считается, что фермент "работает" по механизму "переворачивания нуклеотида", чтобы плотно сблизить основание субстрата и нуклеофильный активный центр AGT.

Важность AGT в защите млекопитающих от токсического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов была продемонстрирована на мышах. Трансгенные мыши с чрезмерной экспрессией AGT проявляют значительно более низкий уровень возникновения опухолей в ответ на действие метилирующего агента - N-метил-N-нитрозомочевины, в то время как мыши с дефицитом AGT оказывались на много более восприимчивы к инициированию опухоли и токсическим эффектам этого агента по сравнению с немутантными мышами. AGT - важный фермент в противоопухолевой терапии так как он препятствует цитотоксическим эффектам противоопухолевых агентов класса хлороэтилнитрозомочевины (CENU), например
BCNU (N,N-бис(2-хлороэтил)N-нитрозомочевина) или темозоломид. Было показано, что количество, в котором присутствует AGT в опухолях, в основном определяет на сколько благоприятным окажется исход противоопухолевой терапии с использованием CENU. CENU первоначально взаимодействует с O6-карбонильной группой гуанина с образованием соединения 4, которое впоследствии преобразуется в N1,O6-этаногуанин 5. Соединение 5 перегруппируется в течение нескольких часов в физиологически активный ICL 6. AGT препятствует образованию 6 при взаимодействии с 4 или 5, возобновляя гуанин или формируя DNA-белковый аддукт 8. Экспериментально получено подтверждение образования аддукта 8, но он был выделен в слишком малом количестве для его детального описания. При биохимическом исследовании этой проблемы был введен N1,O6-этаноксантин
9 как стабильный аналог 5 в DNA. Этаноксантин 9 реагирует с AGT с образованием стабильного DNA-белкового аддукта 7. Этот подход позволил формировать ковалентно связанный AGT-DNA аддукт 10 в большом количестве, который может быть использован для определения структуры AGT связанного с DNA. Взаимовлияние AGT и алкилирующей терапии привело к поиску ингибиторов AGT, которые могут быть использованы в терапии рака в сопряжении с алкилирующими агентами. К настоящему времени созданы ингибиторы, главным образом, производные гуанина с заместителями в O6-позиции. O6-бензилгуанин 2 был обнаружен как типичный ингибитор AGT, с которым сравнивают новые молекулы. Эффективность O6-BzG в усилении цитотоксичности CENU продемонстрирована на моделях животных. Лимитирующим фактором этого терапевтического подхода является токсичность для здоровых органов, частично для костного мозга. Некоторые
группы ученых направлены обойти эту проблему путем генерирования ATG-варианта, устойчивого к ингибированию O6-BzG, что может быть использовано для защиты костного мозга при помощи генного переноса.


Оксидоредуктазы AlkB, hABH2 и hABH3

Еще один путь прямой репарации алкилированных оснований - окисление алкильной группы с регенерацией неповрежденного азотистого основания. Фермент AlkB у Escherichia coli и два человеческих аналога hABH2 и hABH3 направленно деметилируют 1-метиладенин и 3-метилцитозин в DNA. Но в отличие от AGT, эти ферменты обладают субстратной специфичностью, направленной на поверхность пар оснований G:C и A:T. Повреждения 1-алкиладенин
и 3-метилцитозин формируются когда аденин и цитозин находятся в одноцепочечной структуре (в период репликации или транскрипции) и являются субстратами для AlkB, hABH2 и hABH3. Они окисляют метильные группы 1-метиладенина (1-meA) и 3-метилцитозина (3-meC) в DNA для регенерации азотистых оснований аденина и цитозина. Было также показано, что AlkB защищает от токсичного повреждения - аддукта с этильной группой и преобразует 1-этиладенин в аденин в DNA, продуцирующий в результате реакции ацетальдегид. Таким образом репарируются повреждения известного мутагена и канцерогена этиленоксида, эндогенно образующегося в ходе метаболизма этилена, а также широко применяющегося как фумигант для стерилизации. Аддукты с гидроксиэтилом, генерируемые этиленоксидом обнаружены в DNA клетки. Другие малые алкилирующие эпоксиды также задействованы в большом количестве в химическом производстве. Было показано, что AlkB снижает токсические эффекты DNA-повреждающих агентов, генерирующих гидроксиэтильный,
пропильный и гидроксипропильный аддукты. AlkB репарирует алкилированные трифосфаты 1-me-dATP активно, но неэффективно. Предполагалось, что эта способность может снижать уровень встраивания алкилированных трифосфатов при синтезе DNA; к тому же Фрагмент Кленова DNA полимеразы I у E. coli может использовать 1-me-dATP как предшественник для синтеза DNA in vitro. Человеческие ферменты hABH2 и hABH3 также деметилировали 1-метиладениновые остатки в поли(dA), они были неэффективны на коротких субстратах. Таким образом hABH3 обладал очень низкой активностью на тримере d(Tp1-meApT), тогда как у hABH2 активности не было обнаружено.

AlkB и его человеческие аналоги является частью -кетоглутарат/Fe(II)-зависимого суперсемейства диоксигеназ, и в процессе репарации протекает свместно декарбоксилирование -кетоглутарата и окислительное деметилирование поврежденного основания. Повреждения 1-meA и 3-meC формируются в основном в одноцепочечной DNA и предположительно
возникают в репликативной вилке и в активно транскрибируемых генах где они могут заблокировать DNA- и RNA-полимеразы. В действительности AlkB, hABH2 и hABH3 репарируют эти повреждения в одноцепочечной DNA, но также протекает репарация олигонуклеотидов, отожженных с комплементарной цепью после алкилирования. Эффективность репарации 1-метиладенина AlkB не зависит от полинуклеотидной структуры, но необходимо наличие нуклеотид-5'-фосфатной группы. Также человеческие ферменты hABH2 и hABH3 деметилировали остатки 1-метиладенина в поли(dA), они были неэффективны на коротких субстратах. К тому же, повреждения, содержащие положительный заряд (рибонуклеозиды 1-meA и 3-meC имеют соответственно pKa= 9.3 и 9.6) лучше репарировались, чем незаряженные основания (1-meG и 3-meT). Однако, так как 1-meG (и в меньшей степени 3-meT) репарировались AlkB, то формальный положительный заряд основания не является необходимым условием для функционирования AlkB. С этой точки зрения
пока неясно, зависит ли этот результат от того, что положительно заряженные основания лучше распознаются посредством электростатических взаимодействий с AlkB или положительно заряженные основания просто делают DNA лучшей уходящей группой после гидроксилирования метильной группы.

Сокращения:

  • AGT - алкилгуанин трансфераза
  • BER - эксцезионная репарация оснований
  • DNA - дезоксирибонуклеиновая кислота
  • RNA - рибонуклеиновая кислота
  • BCNU - N,N-бис(2-хлороэтил)N-нитрозомочевина
  • CENU - хлороэтилнитрозомочевина
  • O6-BzG - O6-бензилгуанин
  • 1-meA - 1-метиладенин
  • 1-meG - 1-метилгуанин
  • 3-meC - 3-метилцитозин
  • 3-meT - 3-метилтимин

Литература: 

» Orlando D. Scharer (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42, 2946-2974
» James C. Delaney and John M. Essigmann Mutagenesis, genotoxicity, and repair of 1-methyladenine, 3-alkylcytosines, 1-methylguanine, and 3-methylthymine in alkB Escherichia coli
» Pertti Koivisto, Tod Duncan, Tomas Lindahl, and Barbara Sedgwick Minimal Methylated Substrate and Extended Substrate Range of Escherichia coli AlkB Protein, a 1-Methyladenine-DNA Dioxygenase*
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T. & Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16660-16665. 5. Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., et al. (2003) Nature 421, 859-863.
» Hollis, T., Lau, A., and Ellenberger, T. (2000) Mutat. Res. 460, 201-210
» Daniels, D. S., and Tainer, J. A. (2000) Mutat. Res. 460, 151-163
» Trewick, S. C., Henshaw, T. F., Hausinger, R. P., Lindahl, T., and Sedgwick, B. (2002) Nature 419, 174-178
» Falnes, P. O., Johansen, R. F., and Seeberg, E. (2002) Nature 419, 178-181
» Duncan, T., Trewick, S. C., Koivisto, P., Bates, P. A., Lindahl, T., and Sedgwick, B. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 16660-16665
» Aas, P. A., Otterlei, M., Falnes, P. O., Vagbo, C. B., Skorpen, F., Akbari, M., Sundheim, O., Bjoras, M., Slupphaug, G., Seeberg, E., and Krokan, H. E. (2003) Nature 421, 859-863
» Aravind, L., and Koonin, E. V. (2001) Genome Biology 2, 0007.1-0007.8
» Bodell, W. J., and Singer, B. (1979) Biochemistry 18, 2860-2863
» Boiteux, S., and Laval, J. (1982) Biochimie (Paris) 64, 637-641
» Larson, K., Sahm, J., Shenkar, R., and Strauss, B. (1985) Mutat. Res. 150, 77-84
» Dinglay, S., Trewick, S. C., Lindahl, T., and Sedgwick, B. (2000) Genes Dev. 14, 2097-2105