Репликация у прокариот

Репликацию ДНК удобнее всего рассматривать на бактерии E.coli, как на наиболее изученном прокариотическом организме.
Направление движения вилки репликацииНаправление движения вилки репликации

Репликация происходит одновременно в двух направлениях от места начала репликации. Обе цепи синтезируются холоэнзим ДНК-полимеразой III. Одна из альфа субъединиц холоэнзима синтезирует лидирующую, тогда как другая альфа субъединица синтезирует отстающие цепи, называемые фрагментами Оказаки, имеющие 10 РНК нуклеотидов на 5' конце (РНК-праймер) и около 1000 нуклеотидов ДНК. РНК-праймер удаляется ДНК-полимеразой I и фрагменты сшиваются друг с другом ДНК лигазой.

ДНК-полимеразы E.coil

У E.coli имеется пять различных ДНК-полимераз.

Pol I

pol I представлена одним полипептидом с тремя активностями:

  • полимеразная - катализирует перенос нуклеотидов к 3'-концу праймера ДНК или РНК и спаривание комплементарного нуклеотида
  • 3'-5'-экзонуклеазная - удаляет 3'-концевые ошибочно встроенные нуклеотиды, препятствуя образованию мутаций
  • 5'-3'-экзонуклеазная - удаляет 5'-концевые нуклеотиды

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстаю- щей цепи. Pol I удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку Pol I способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией). этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК

Трипсин расщепляет Pol I на два фрагмента: большой C-концевой «фрагмент Кленова» (ДНК-полимераза, 3'-5'-экзонуклеаза) и малый N-концевой (5'-3'-экзонуклеаза).

Pol II

Pol II присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Pol I, и не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью. Следовательно, Pol II может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не спо- собна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. присутствуют в клетке в меньших количествах.

Pol III

Pol III-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится только 10–20 копий Pol III-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, Но поскольку Pol III-xoлофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие Pol I, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.

?-субъединица обладает полимеразной активностью, а ?-субъединица -3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс ?- и ?-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, ?-субъединицы пока неясна.

Помимо субъединиц, составляющих Pol III-кор, Pol III-холофермент содержит еще семь субъединиц: ?, ?, ?, ?, ?', ? и ?. Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате молекулярная масса комплекса составляет примерно 103 кДа. Роль ?-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна.

Pol III-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой отстающей.

Pol III-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и Pol I, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, Pol III-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования.

Pol III-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации.

На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (расплетазы или геликазы), инициирующие образование праймерных РНК праймазы), обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК

Инициация репликации на oriC

Синтез лидирующей цепи ДНК

Синтез отстающей цепи ДНК

Созревание фрагментов Оказаки

Терминация ДНК-репликации

Окончание репликации ter (terminus) находятся на противоположной стороне от ориджина кольцевой хромосомы E. coli. Ter сайты работают как ловушки: репликационная вилка попадает и не выходит из этой области в 450 тысяч пн. Имеется 6 ter сайтов терминации. Белок Tus связывается с ter сайтами и останавливает гиликазу DnaB. Синтез ведущей цепи ДНК останавливается в 1 нуклеотиде от места связывания белка Tus. Ter сайты работают только в одном направлении. Для каждого раунда репликации, только один сайт терминации обычно используется. Остановившаяся на сайте терминации вилка ждет другую вилку, которая придет с другой стороны.

Расхождение дочерних кольцевых молекул ДНК

Для разделения дочерних кольцевых молекул ДНК требуется действие топоизомераз. Топоизомераза IV (parC и parD) выполняет эту функцию. Работает совместно с топоизомеразой II (gyrase, gyrA и gyrB).